Другой подход для электронно-микроскопической идентификации полипотентных стволовых кроветворных клеток был избран Rubnsten и Trobaugh (1973). С этой целью авторы использовали свойство ГСК сохранять жизнеспособность после глубокого охлаждения и оттаивания. Так, было показано, что в суспензии костного мозга мышей, охлажденной до -100 С и оттаянной с помощью защитной техники, большая часть зрелых клеток крови разрушается, но репопуляциониая активность ее снижается менее чем на 5%, что дает возможность легче обнаружить ГСК. По данным этих авторов, предполагаемые ГСК круглые или овальные клетки, по величине около 8 мкм. В них содержится круглое или овальное ядро с волнистым контуром, в котором могут обнаруживаться единичные нуклеолы. Узкий ободок цитоплазмы содержит многочисленные рибосомы и несколько небольших круглых или овальных митохондрий, которые обычно располагаются в складках ядерной мембраны. Встречаются также короткие профили шероховатого эндоплазматического ретикулума и везикулы. Очень редко выявляется аппарат Гольджи. Следовательно, предполагаемые ГСК, описанные этими авторами, по своей ультраструктуре несколько отличаются от описанных предыдущими авторами, больше приближаясь к лимфоидным клеткам. Читать полностью »
Среди лабораторных методов исследования, имеющих ориентировочное увеличение количества лимфоцитоподобных клеток, отличающихся от малых лимфоцитов особенностями ультраструктуры. В исследуемых образцах костного мозга преобладали круглые клетки диаметром 8-9 мкм, с округлым или неправильной формы большим ядром, имеющие определенное сходство с лимфоцитами. В отличие от малых лимфоцитов лимфоидных органов у них более тонкая структура хроматина ядра, очертания которого имеют фестончатый вид. Нередко хорошо контурировалось ядрышко. В цитоплазме содержалось большое количество рибосом и полисом, нередко встречались маленькие везикулы. Митохондрии небольшого размера, обычно округлые, относительно равномерно распределялись вокруг ядра. Элементы шероховатой эндоллазматической сети встречались редко в виде коротких отдельных профилей. Зона Гольджи отсутствовала. Данные мононуклеары по своей ультраструктуре напоминали предполагаемые стволовые клетки в костном мозге мышей, описанные в 1973 г. Rubnsten и Trobaugh. Эти клетки сохранялись в костном мозге при глубоком его охлаждении, в результате чего большинство зрелых клеток разрушалось, а колониеобразующие свойства костного мозга почти не изменялись. Читать полностью »
Учитывая вышеизложенное, в выполненных нами исследованиях на мышах линии СмВL и BALBc свеже-синтезированную оксимочевину в количестве 500 мг на 1 кг веса вводили животным 3 раза с интервалом 4- б ч. Через 36 ч после последнего введения их забивали, готовили суспензию костномозговых клеток и в количестве 10 -10е вводили в хвостовую вену летально облученным мышам для определения колониеобразующей способности по классической методике Tll и McCuoch (1961), В контроле облученным животным вводили такое же количество клеток костного мозга интактных мышеи. Из клеточных суспензий костного мозга готовили препараты для электронной и световой микроскопии (Вутенко в др., 1974; Зак, 1977). В ряде опытов костномозговые клетки подвергали дифференциальному центрифугированию в градиенте плотности альбумина и исследовали обогащенную стволовыми клетками фракцию клеток, выделенных в 21%-ном растворе бычьего альбумина, С целью дифференциации клеток моноцитариого ряда проводили ультрацитохимическое определение активности пероксидазы (Graham, Karooveky, 1966). Читать полностью »
В связи с открывшимися большими возможностями современной науки следует признать правильной существующую тенденцию многих ученых, нацеленную на попытки идентификации стволовых клеток и клеток-предшественников. Решение этого вопроса находится не пути дальнейшего усовершенствования цитологических и молекулярно-биологических методических приемов, дающих возможность получать фракции, сознательно обогащенные стволовыми клетками, и изучать их на ультраструктурном и ультрацитохимическом уровнях, внедрение в практику гематологических исследований электронной микроскопии, ультраструктурной цитохимии и электронно-микроскопической иммунологии приобрело огромное значение. Благодаря этим методам стало возможным идентифицировать кровяные клетки на уровне их органоидов - величины, расположения, субмикроскопического строения, а также внутриклеточного обмена, наличия или отсутствия рецепторов или маркеров. Разработанные в самые последние годы методы трансмиссионной и сканирующей электронной микроскопии с использованием различных иммунологических меток следует считать чрезвычайно перспективными для решения рассматриваемого вопроса. Читать полностью »
При исследовании в световом микроскопе окрашенных по Май-Грюнвальду - Романовскому образцов костного мозга мышей, взятых через указанные выше промежутки времени после введения оксимочевины, была выявлена закономерная корреляция между изменением колониеобразования и процентным содержанием лимфо-цитолодобных клеток трансплантированного костного мозга. К лимфоцитоподобным клеткам относили как типичные лимфоциты, так и все другие мононуклеазы, которые по своему строению, определяемому в световом микроскопе, имели сходство с ними. Следует отметить, что через 36 ч после введения оксимочевины в образцах костного мозга с высокой колониеобразующей способностью, а также во фракции костного мозга, полученной в этот срок исследования дифференциальным центрифугированием, в градиенте плотности альбумина появляется значительное число окрашивающихся в пурпурный цвет клеток, подобных лимфоцитам, но отличающихся от них только несколько большим размером и более гомогенной структурой хроматина ядра. Читать полностью »
В ряде работ (Worton е. а,, 1969; Moore е. я,, 1974) подробно описываются методы разделения клеток костного мозга в норме и патологии, М. Мур и Д. Меткалф (1973) подчеркивают, что наиболее эффективный путь выявления свойств клеток и различий между клеточными популяциями - это их физическое разделение, С помощью этих методов (Worton е. а,, 1969) удается отделить стволовые кроветворные клетки костного мозга, дающие образование колоний в селезенке летально облученных животных от колониеобразующих клеток культур. Клетки разделяли на несколько фракций в зависимости от их плотности путем центрифугирования в линейном градиенте плотности 14-37%-иого бычьего сывороточного альбумина (V фракция). В результате подсчета в каждой фракции общего количества клеток и отдельно КОЕ дана (Hyp, Меткалф, 1973) характеристика колониеобразующих клеток культур по плотности и по величине. Читать полностью »
Наряду с описанными выше клетками в исследуемых образцах костного мозга, особенно во фракции 21%-наго альбумина, полученной методом дифференциального центрифугирования и обогащенной ГСК, мы наблюдали и другой вид мононуклеаров. По своему субмикроскопическому строению эти клетки подобны описанным Bekkum и соавторами (1971), назвавших ах кандидатами гемопоэтических стволовых клеток. Самое тщательное обследование этих людей не показывает никаких признаков повышенного гемолиза. Клинические признаки эллиптоцитарной гемолитической . анемии практически не отличаются от проявлений микро-сфероцитоза. Часто увеличена селезенка, так как в ней происходит преимущественная секвестрация эритроцитов. У больных могут быть анемия различной выраженности, раздражение красного ростка костного мозга, повышение содержания ретикулоцитов и непрямого билирубина. Объем эритроцитов, концентрация гемоглобина в эритроцитах не отличаются от нормы. Читать полностью »